Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
по использованию альтернативного метода взамен фармакопейного теста приведено в разделе «Общие положения»:
«Описанные испытания и методики количественного определения являются официальными методами, на которых основаны стандарты Фармакопеи. По соглашению с компетентными органами в целях контроля могут использоваться альтернативные методы анализа, при условии, что используемые методы позволяют сделать определенное заключение о том, может ли быть достигнуто согласие со стандартами статей, если бы были использованы официальные методы. В сомнительных и спорных случаях единственными надежными методами считают методы, приведенные в Фармакопее».
Для валидации метода испытания на бактериальные эндотоксины, отличного от подразумеваемого или указанного в частной статье, предлагаются следующие процедуры.
13.1. Процедура, материалы и реагенты, используемые при проведении испытания с применением лизата амебоцитов, должны пройти валидацию в соответствии с указаниями, приведенными в испытании на бактериальные эндотоксины.
13.2. Должно быть проведено испытание на наличие мешающих факторов (и, при необходимости, процедура по их исключению) на образцах, отобранных, по меньшей мере, из трех партий продукции. Следует иметь в виду, что в методах D и Е, использующих хромогенный пептид, требуются реагенты, не используемые в методах А, В, С и F, и поэтому соответствие методов А, В, С и F требованиям, предъявляемым к мешающим факторам, не может быть без соответствующего подтверждения экстраполировано на методы D и Е.
14. ВАЛИДАЦИЯ ИСПЫТАНИЯ ДЛЯ НОВЫХ ПРОДУКТОВ
Процедуры, описанные в пунктах 13.1 и 13.2, должны быть выполнены для всех новых продуктов, предназначенных для парентерального применения, которые, в соответствии с требованиями Фармакопеи, должны быть подвергнуты испытанию на наличие бактериальных эндотоксинов.
2.6.15. АКТИВАТОР ПРЕКАЛЛИКРЕИНА
Активатор прекалликреина (АПК) активирует прекалликреин, переводя его в калликреин, и может быть определен по его способности к отщеплению хромофора от синтетического пептидного субстрата в условиях, позволяющих определять скорость распада спектрофотометрическим методом; концентрация АПК вычисляется путем сравнения со стандартным препаратом, калиброванным в Международных Единицах.
За Международную Единицу принята активность установленного количества Международного Стандарта, представляющего собой лиофильно высушенный активатор прекалликреина. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУБСТРАТА ПРЕКАЛЛИКРЕИНА
Для предотвращения активации коагуляции кровь или плазма, используемая для приготовления прекалликреина, должна контактировать только с пластиком или стеклянными поверхностями, обработанными силиконом.
9 объемов человеческой крови приливают к 1 объему антикоагулянтного раствора (ACD, CPD или раствора цитрата натрия R концентрацией 38 г/л), к которому добавлен гексадиметрина бромид R в количестве 1 мг/мл. Смесь центрифугируют при 3600 g в течение 5 минут. Отделяют плазму и снова центрифугируют при 6000 g в течение 20 минут для осаждения тромбоцитов. Плазму с уменьшенным содержанием тромбоцитов отделяют и подвергают диализу против 10 объемов буфера А в течение 20 часов. Диализированную плазму наносят на хроматографическую колонку, содержащую агарозу-DEAE для ионообменной хроматографии R, уравновешенную с помощью буфера А, в количестве, равном двойному объему плазмы. Колонку элюируют буфером А со скоростью 20 мл/см2/ч. Собирают фракции элюата, регистрируя оптическую плотность при 280 нм (2.2.25). Фракции, содержащие первый пик белка, объединяют таким образом, чтобы объем объединенных фракций составлял 120% объема плазмы с пониженным содержанием тромбоцитов.
Проверяют отсутствие калликреиновой активности в объединенном растворе субстрата, смешивая его в соотношении 1:20 с предварительно подогретым раствором хромогенного субстрата, который будет использоваться в определении, и инкубируют при 370С в течение 2 минут. Субстрат может быть использован в испытании, если увеличение оптической плотности составляет менее 0,001 единицы в минуту. К собранному раствору добавляют натрия хлорид R в количестве 7 г/л и фильтруют через мембранный фильтр (пористость 0,45 мкм). Порции субстрата замораживают и хранят при температуре -250С; субстрат перед хранением может быть подвергнут высушиванию из замороженного состояния.
Все процедуры от начала хроматографии до заморозки порций субстрата выполняют в течение одного рабочего дня.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Определение предпочтительно выполнять с использованием автоматического анализатора ферментов при температуре 370С, используя такие объемы, концентрации субстратов и времена инкубации, чтобы скорость реакции находилась в линейной зависимости, по крайней мере, до концентрации 35 МЕ/мл. Стандарты, образцы и субстрат прекалликреина могут быть при необходимости разбавлены буфером В.
Разбавленные стандарты или образцы инкубируют с субстратом прекал-ликреина в течение 10 минут так, чтобы объем неразбавленного образца не превышал 1/10 общего объема инкубируемой смеси, во избежание ошибок, связанных с изменением ионной силы и показателя рН инкубируемой смеси. Смесь или ее часть инкубируют не менее, чем с равным объемом раствора подходящего синтетического хромогенного субстрата с установленной специфичностью к кал-ликреину (например, N-бензоил-і-пролил-і-фенилаланил-і-аргинина 4-
